Mouse IL-6 ELISA試劑盒原理說明
IL-6 簡介: 白細(xì)胞介素 6(IL-6)是一種多功能蛋白,在宿主防御、急性期反應(yīng)、免疫反應(yīng)和造血中發(fā)揮重要作用。IL-6 由各種正常和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá),包括 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、 星形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和各種腫瘤細(xì)胞。IL-6 的產(chǎn)生被許多信號上調(diào),包括有絲分裂或抗原刺激、LPS、鈣 離子團(tuán)、IL-1、IL-2、IFN、TNF、PDGF 和病毒。IL-6 在單核細(xì)胞中的表達(dá)受到 IL-4 和 IL-13 的抑制。
實驗原理: 本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被有小鼠白細(xì)胞介素 6(IL-6)捕獲抗體的 微孔中,依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測抗體,HRP 酶結(jié)合物,中間經(jīng)過溫育和洗滌,用底物 TMB 顯色,TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中 的小鼠白細(xì)胞介素 6(IL-6)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
試劑盒參數(shù): 需自備的設(shè)備及試劑: 1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀 2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL. 3. Eppendorf 移液器. 4. 蒸餾水或去離子水. 5. 脫脂棉吸水紙. 6. 37℃恒溫箱. 8. 準(zhǔn)備若干個標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.
樣本處理及要求:
1. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍,建議實驗前通過相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測物的濃度并 通過預(yù)實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或過低,請對樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。
2. 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中,建議做預(yù)實驗驗證其檢測有效性。
3. 血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時或 4℃過夜,然后 1000×g 離心 20 分鐘,取上清 即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4. 血漿:用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8℃1000×g 離心 15 分鐘, 取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿:用預(yù)冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié) 果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的 PBS(一般按 1:9 的重量體積比,比如 1g 的組織樣 品對應(yīng) 9mL 的 PBS,具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑) 加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍 融。最后將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘,取上清檢測。
6. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請 1000×g 離心 20 分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免 反復(fù)凍融。
7. 其它生物標(biāo)本:1000×g 離心 20 分鐘,取上清即可檢測。
8. 樣品外觀:樣品應(yīng)清澈透明,懸浮物應(yīng)離心去除。
9. 樣品保存:樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于 4℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍 存于-20℃(1 個月內(nèi)檢測),或-80℃(6 個月內(nèi)檢測),避免反復(fù)凍融,標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果, 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。 性能 靈敏度 2.63pg/mL 檢測范圍 7.81-500pg/mL 特異性 可檢測樣本中小鼠的 IL-6,且與其類似物無明顯交叉反應(yīng).
操作步驟: 1. 從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回 4℃。
2. 加樣:分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照 100μl 每孔加入相應(yīng)孔中,空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時。(建議:將待測樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測試。從 而減少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的誤差影響,最后計算樣本濃度時需乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和 標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔)。
3. 加生物素化抗體:取出酶標(biāo)板,棄去液體,不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100μL,蓋上封 板膜后 37℃溫育 1 小時。
4. 洗板:棄去液體,每孔加入 300μL 1x 洗滌液,靜置 1 分鐘,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板 3 次(也可用洗板機(jī)洗板)。
5. 加酶結(jié)合物工作液:每孔加入酶結(jié)合物工作液 100μL,蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。
6. 洗板:棄去液體按步驟 4 洗滌方法,洗板 5 次。
7. 加底物:每孔加入底物(TMB)90μL,蓋上封板膜,37℃避光溫育 15 分鐘。
8. 加終止液:取出酶標(biāo)板,每孔直接加入終止液 50μL,立即在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。
結(jié)果判斷:
1. 計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時去掉空白組的值)。
2. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
典型數(shù)據(jù)和參考曲線:
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
濃度(pg/mL) | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.25 | 15.62 | 7.81 | 0 |
OD值 | 2.28 | 1.24 | 0.67 | 0.35 | 0.19 | 0.14 | 0.11 | 0.09 |
校正OD值 | 2.19 | 1.15 | 0.58 | 0.26 | 0.1 | 0.05 | 0.02 | - |
試劑盒性能:
1. 重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10%,板間變異系數(shù)小于10%。
2. 回收率:在選取的健康小鼠血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個不同濃度水平的小鼠IL-6,計算回收率
樣本類型 | 范圍 | 平均回收率 |
血清(n=8) | 87-101 | 96 |
血漿(n=8) | 96-105 | 102 |
細(xì)胞培養(yǎng)上清(n=8) | 98-108 | 105 |
3. 線性稀釋:分別在選取的4份健康小鼠血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠IL-6,在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋,評估線性。
稀釋比例 | 回收率(%) | 血清 | 血漿 | 細(xì)胞培養(yǎng)上清 |
1:2 | 范圍(%) | 86-95 | 88-96 | 90-110 |
平均回收率(%) | 91 | 93 | 98 | |
1:4 | 范圍(%) | 89-103 | 87-108 | 107-115 |
平均回收率(%) | 94 | 99 | 108 |