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磺胺多殘留檢測試劑盒 使用說明書 (酶聯(lián)免疫法)

發(fā)布時間:2022-11-01   點擊次數(shù):1357次

磺胺多殘留檢測試劑盒

使用說明書

(酶聯(lián)免疫法)

 

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶、尿液、雞蛋等樣本中的磺胺類藥物(Sulfonamides,SAs),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的磺胺類藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度:0.5ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式:25℃,45min15min

2.3 檢測下限:

組織(高檢測限方法)……………0.5ppb

組織(低檢測限方法)……………2.5ppb

血清、尿液、雞蛋…………………2ppb

蜂蜜…………………………………0.5ppb

牛奶…………………………………10ppb

水樣…………………………………1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率:

藥物名稱

交叉率

靈敏度ppb

磺胺二甲基嘧啶(SM2)

100%

0.5

磺胺間甲氧嘧啶(SMM)

670%

0.07

磺胺對甲氧嘧啶(SMD)

582%

0.09

磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM')

451%

0.1

磺胺甲基嘧啶(SM1)

313%

0.15

磺胺嘧啶(SD或SDZ)

308%

0.15

磺胺二甲異嘧啶(SM2')

241%

0.2

磺胺間二甲氧嘧啶(SDM)

175%

0.3

磺胺甲噻二唑(SMT)

165%

0.3

磺胺氯吡嗪(Esb3)

67%

0.8

磺胺噻唑(ST)

58%

0.9

磺胺氯噠嗪(SCPA)

58%

0.9

磺胺甲氧噠嗪(SMP)

57%

0.9

磺胺喹噁啉(SQX)

42%

1

磺胺異噁唑(SIZ)

18%

3

磺胺甲噁唑(SMZ)

18%

3

 2.5 樣本回收率:

組織、蜂蜜、水樣………………95±25%

尿樣、牛奶、血清………………85±25%

雞蛋………………………………90±25%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml

0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):1ppm ……………1ml

酶標(biāo)記物(紅蓋)……………………5.5ml

抗體工作液(藍(lán)蓋)…………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

2×復(fù)溶液(黃蓋) …………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2 微量移液器:單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑:乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCL 、NaH2PO4·2H2O 

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知:

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液:

配液1:0.2M NaOH溶液

    稱取0.8g NaOH 加去離子水混勻溶解,定容至100ml。

配液2:0.02M PB緩沖液

    稱取2.58g Na2HPO4·12H2O和0.44g NaH2PO4·2H2O加去離子水混勻溶解,定容至500ml。

配液3:0.5M鹽酸溶液

    4.3ml濃HCL加入去離子水混勻,定容至100ml。

配液4:復(fù)溶液(注:若檢測樣本為水樣則勿配此液)

2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋(1份復(fù)溶液加1份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液5:工作洗滌液

    濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟:

5.3.1組織樣本(高檢測限)處理方法

1)稱取3g±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中,加入3ml 0.02M PB緩沖液充分振蕩混勻,再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈,充分振蕩10min,于4000轉(zhuǎn)/min分鐘以上速度離心10分鐘;

2)移取2ml上層液體(約相當(dāng)于1g的樣本)在50-60℃氮氣或空氣吹干;

3)加1ml正己烷溶解干燥的殘留物,再加1ml復(fù)溶液,強烈振蕩1min,4000轉(zhuǎn)/分鐘,離心5分鐘;

4)除去上層正己烷,取下層水相50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):1    檢測下限:0.5ppb 

5.3.2 組織樣本低檢測限處理方法

1)稱2.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中;加入8ml 0.02M PB緩沖液,震蕩2分鐘,4000轉(zhuǎn)/分鐘以上離心10分鐘;

2)取50µl液體用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù): 5    檢測下限:2.5ppb  

5.3.3血清樣本處理方法

1)將血樣本于室溫放置30分鐘,于4000轉(zhuǎn)/分鐘以上離心10分鐘,分離出血清或過濾血清;

2)取1ml血清,加入3ml 0.02 M PB緩沖液混合,混合30s;

3)取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù):4    檢測下限:2ppb  

5.3.4 蜂蜜樣本處理方法

1)稱取1g±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中,加入1ml 0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30分鐘;

2)加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5分鐘,4000轉(zhuǎn)/分鐘以上室溫離心10分鐘;

3)取2ml上層液體于50-60℃下氮氣或空氣吹干,加0.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶,混合30秒;

4)取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù):1    檢測下限:0.5ppb

5.3.5 尿樣本處理方法

1)用3ml 0.02 M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合,混合30秒;

2)取50µl液體用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測下限:2ppb 

5.3.6牛奶樣本處理方法

1)將牛奶樣本用0.02 M PB緩沖液20倍稀釋(如20µl牛奶+380µl 0.02M PB緩沖液),混合30秒;

2)取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):20    檢測下限:10ppb   

5.3.7水樣處理方法

1)取水樣200ul加入200ul 2×復(fù)溶液,混合30秒;

2)取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):2    檢測下限:1ppb   

5.3.8 雞蛋樣本處理方法

1)用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本,使蛋清和蛋黃充分混合;

2)稱取2.0g±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本(蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋)至50ml離心管中,加入8ml乙腈,立即用振蕩器振蕩10分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分鐘以上離心5分鐘;

3)移取2ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于,于50-60℃氮氣或空氣吹干;

4)加入1ml正己烷,用渦旋儀渦動30秒溶解干燥的殘留物,再加入1ml復(fù)溶液,用渦旋儀渦動1分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分鐘以上離心5分鐘;

5)去上層有機相,取下層水相50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 2    檢測下限:1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

6.1    號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3    滌:小心揭開蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350µl l工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

6.4    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘若藍(lán)色過淺,可適當(dāng)延長反應(yīng)時間)。

6.5     止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即

 百分吸光度值(%)=

A

×100%

A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)光率為縱坐標(biāo),對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索取)

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫(25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻,洗板要洗凈,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上要使用過了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號試劑盒中的取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。

8.5 不試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位(A450nm< 0.5 )時,表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。

 

9 貯藏及保存期

儲藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。

質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。


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