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人白細(xì)胞介素17(IL-17)ELISA試劑盒-2022動(dòng)態(tài)已更新

發(fā)布時(shí)間:2022-09-06   點(diǎn)擊次數(shù):940次


人白細(xì)胞介素17(IL-17)ELISA試劑盒-2022動(dòng)態(tài)已更新

微信圖片_20220906125313.jpg


實(shí)驗(yàn)原理


試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被人白細(xì)胞介素17(IL-17)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人白細(xì)胞介素17(IL-17)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。


 

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樣本處理及要求


1.  血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。


2.  血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。


3.  組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測(cè)。


4.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:請(qǐng)1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。


注:標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。


 


需要而未提供的試劑和器材


1. 酶標(biāo)儀(450nm)


2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL


3. 37℃恒溫箱


4. 蒸餾水或去離子水


 


試劑盒組成


 


名稱


96孔配置


48孔配置


備注


微孔酶標(biāo)板


12孔×8條


12孔×4條


無(wú)


標(biāo)準(zhǔn)品


0.3mL*6管


0.3mL*6管


無(wú)


樣本稀釋液


6mL


3mL


無(wú)


檢測(cè)抗體-HRP


10mL


5mL


無(wú)


20×洗滌緩沖液


25mL


15mL


按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋


底物A


6mL


3mL


無(wú)


底物B


6mL


3mL


無(wú)


終止液


6mL


3mL


無(wú)


封板膜


2張


2張


無(wú)


說(shuō)明書(shū)


1份


1份


無(wú)


自封袋


1個(gè)


1個(gè)


無(wú)


備注:


1.  標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:320、160、80、40、20、10 pg/mL


2.  經(jīng)過(guò)大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過(guò)最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí),可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。


 


注意事項(xiàng)


1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。


2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。


3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。


4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。


5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。


6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。


7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。


8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。


9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。


10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。


 


試劑準(zhǔn)備


試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。


20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。


 


操作步驟


1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。


2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;


3.  樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL;空白孔不加。


4.  除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。


5.  棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。


6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。


7.  每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。


 


實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算


以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到直線回歸方程,將樣品的OD值代入方程,計(jì)算出樣品的濃度。


 


試劑盒性能


1.  檢測(cè)范圍:10 pg/mL – 320 pg/mL。


2.  靈敏度:檢測(cè)濃度小于1.0 pg/mL。


3.  特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。


 重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,板間變異系數(shù)小于15%


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