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瘦素檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)操作說(shuō)明

發(fā)布時(shí)間:2021-11-09   點(diǎn)擊次數(shù):1997次

瘦素檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)操作說(shuō)明

瘦素檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:瘦素檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)

英文名稱:Leptin (Sandwich) ELISA

 

【產(chǎn)品規(guī)格】

96T

 

【預(yù)期用途】

試劑盒可用于人血清和血漿中瘦素的定量檢測(cè)

 


【檢測(cè)原理】

DRG公司的瘦素酶免實(shí)驗(yàn)是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA),微孔內(nèi)包被有能結(jié)合瘦素分子上*抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。含有內(nèi)源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進(jìn)行溫育,之后就會(huì)形成一個(gè)夾心復(fù)合物。溫育后,用洗滌液洗去未結(jié)合的物質(zhì),再加入鏈霉親和素過(guò)氧化物酶復(fù)合物來(lái)檢測(cè)結(jié)合的瘦素,加入底物溶液,顏色強(qiáng)度與病人樣品中瘦素的濃度成正比。

 

【試劑盒組成成分】

微孔板          12×8

包被了抗瘦素單克隆抗體。

標(biāo)準(zhǔn)品(0~5   6×0.5ml

濃度0、2、5、25、50、100ng/ml 內(nèi)含無(wú)汞防腐劑。

質(zhì)控品          2×0.5ml

即用型、具體數(shù)值與范圍請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽或QC質(zhì)控單、內(nèi)含無(wú)汞防腐劑。

分析緩沖液      1×11ml

即用型

抗血清          1×11ml

即用型、生物素化抗瘦素單抗、內(nèi)含無(wú)汞防腐劑

酶聯(lián)物          1×11ml

即用型、含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素、內(nèi)含無(wú)汞防腐劑。

底物液          1×14ml

TMB、即用型

終止液          1×14ml

即用型、內(nèi)含0.5M的H2SO4、避免接觸終止液、以免刺激皮膚或灼傷皮膚。

洗滌液          1×30ml

40倍濃縮

注:根據(jù)需要可額外訂購(gòu)樣本稀釋用的零標(biāo)準(zhǔn)品。

所需材料(未提供)

1) 酶標(biāo)儀 (450±10nm)

2) 精確取樣槍

3) 吸水紙

4) 蒸餾水

5) 計(jì)時(shí)器

6) 半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙或數(shù)據(jù)處理軟件

 

【儲(chǔ)存條件】  

未開(kāi)封的試劑在2~8℃下可保存至有效期,不要使用過(guò)期的試劑

開(kāi)封的試劑和微孔板必須貯存于2~8℃,密封袋一旦打開(kāi)后,應(yīng)立即密封好

 

【樣本要求】

此試驗(yàn)采用血清或血漿。

不要使用溶血,脂血或黃疸血樣本。

注意:含有疊氮化物的樣本不能使用

樣本采集

血清

靜脈采血采集全血,允許凝集,室溫下離心分離出血清;樣本未*凝集前不能離心;含有抗凝劑的樣本可能需要更長(zhǎng)的凝集時(shí)間。

血漿

將全血采集至含有抗凝劑的離心管內(nèi),離心分離。

樣本儲(chǔ)存

樣本采集后蓋好蓋子,2~8℃下可保存24小時(shí);若要保存更長(zhǎng)時(shí)間,則需凍存于-20℃;解凍的樣本實(shí)驗(yàn)前來(lái)回倒置數(shù)次混勻。

樣本稀釋

初次試驗(yàn)中,若出現(xiàn)樣本的濃度值高于最高標(biāo)準(zhǔn),則需將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋,并重新檢測(cè),最終結(jié)果應(yīng)乘以相關(guān)的稀釋因子。

例如:

A) 1:10稀釋          10ul的血清+90ul的零標(biāo)準(zhǔn)品(充分混合)

B)1:100稀釋  10ulA)1:10稀釋的+90ul的零標(biāo)準(zhǔn)品(充分混合)

 

【檢測(cè)方法】

實(shí)驗(yàn)前將所有試劑和試驗(yàn)所需板條平衡至室溫。

標(biāo)準(zhǔn)品

0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品試劑瓶?jī)?nèi),,靜置10分鐘,使用前混勻。

注意:配制的標(biāo)準(zhǔn)品在2~8℃下可保存6周,需保存更長(zhǎng)時(shí)間需在-20℃下凍存

質(zhì)控品

0.5ml的去離子水至質(zhì)控品試劑瓶?jī)?nèi),,靜置10分鐘,使用前混勻

注意:配制的標(biāo)準(zhǔn)品在2~8℃下可保存6周,需保存更長(zhǎng)時(shí)間需在-20℃下凍存

洗滌液

30ml的濃縮洗滌液+1170ml的去離子水混合,得到1200ml的即用型洗滌液;稀釋的洗滌液可在室溫下保存2周

檢測(cè)步驟

每次實(shí)驗(yàn)都要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1) 將實(shí)驗(yàn)所需板條固定于板架上。

2) 15ul的標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)控品和樣本于相應(yīng)的孔內(nèi)。

3) 每孔加100ul的分析緩沖液;充分混合10秒,此步中*混合很重要。

4) 室溫下,不蓋板,溫育120min。

5) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液,每孔加300ul的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干。

   注意試驗(yàn)靈敏度和精確度與洗板準(zhǔn)確與否相關(guān)

6) 每孔加100ul的抗血清。

7) 室溫下溫育30min

8) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液,每孔加300ul的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干。

9) 每孔加100ul的酶聯(lián)混合物。

10) 室溫下溫育30min。

11) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液,每孔加300ul的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干

12) 每孔加100ul的底物液。

13) 室溫下溫育15min。

14) 每孔加50ul的終止液。

15) 加入終止液10min內(nèi)在酶標(biāo)儀450±10nm處讀數(shù)。

 

【結(jié)果計(jì)算】

1) 計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)控品和樣本的OD均值。

2) 在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上,以標(biāo)準(zhǔn)品的OD均值為Y軸,濃度為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

3) 樣本的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。

4) 自動(dòng)計(jì)算方法:說(shuō)明書(shū)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)4參數(shù)邏輯函數(shù)法計(jì)算得到,4PL是最佳方法,其他的方法可能會(huì)有些許的偏差。

5) 樣本濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀??;若樣本濃度值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品,則需進(jìn)一步稀釋重新檢測(cè);最終結(jié)果計(jì)算時(shí)應(yīng)乘以相關(guān)的稀釋因子。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線示例

以下數(shù)據(jù)僅供解釋說(shuō)明,不能用作試驗(yàn)的計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)品(ng/ml)

OD值(450nm)

0

0.02

2

0.07

5

0.16

25

0.74

50

1.41

100

2.30

 

【注意事項(xiàng)】

1) 此試劑盒僅供科研使用

2) 試劑盒內(nèi)所有含人血清或血漿的試劑都已經(jīng)過(guò)FDA檢測(cè)HIV I/II, HBsAg 和HCV呈陰性,但使用及處理時(shí)應(yīng)視其為潛在生化危害物質(zhì)對(duì)待

3) 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,認(rèn)真閱讀試劑盒內(nèi)配套的使用說(shuō)明書(shū),確保*理解。

4) 微孔板可拆,未使用的板條應(yīng)放回至密封袋內(nèi)貯存于2-8℃。

5) 每次加樣要快,加樣順序應(yīng)一致

6) 一個(gè)試劑瓶只能用于裝一種試劑,尤其是底物液試劑瓶;若用裝過(guò)了酶聯(lián)物的試劑瓶重新裝底物液的話則會(huì)發(fā)生的溶液顏色改變,且不能將剩余溶液倒回至原試劑瓶,以免污染試劑。

7) 微孔板內(nèi)的試劑應(yīng)*混勻,確保得到好的結(jié)果,不要重復(fù)使用微孔板

8) 試驗(yàn)中,不要使微孔出現(xiàn)干燥,洗板后立即加入下一個(gè)試劑

9) 實(shí)驗(yàn)前將所有試劑平衡至室溫,溫度會(huì)影響吸收值的讀取,但是樣本值不會(huì)受影響。

10) 不要用嘴吸樣,避免接觸試劑和樣本。

11) 實(shí)驗(yàn)區(qū)禁止抽煙,飲食或化妝。

12) 處理樣本和試劑時(shí)佩戴一次性手套,微生物污染的試劑或樣本會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

13) 嚴(yán)格按照相關(guān)國(guó)家生物安全法規(guī)要求來(lái)處理。

14) 不要使用過(guò)期的試劑

15) 加樣量嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求來(lái),使用校準(zhǔn)加樣器和酶標(biāo)儀則會(huì)得到最佳結(jié)果。

16) 不要混合使用不同批次的試劑,也不能交換同一批次的板條;運(yùn)輸或貯存環(huán)境不同和微孔板的結(jié)合特性會(huì)導(dǎo)致結(jié)果些許差異。

17) 避免接觸終止液,會(huì)腐蝕和燒傷皮膚。

18) 含有Proclin 300, BND 和 MIT作為防腐劑的試劑應(yīng)避免接觸,若接觸到則立即用大量水進(jìn)行沖洗。

19) TMB底物液具有刺激作用,若接觸到則立即用肥皂清洗和大量水沖洗。

20) 化學(xué)物質(zhì)和配制的試劑應(yīng)根據(jù)國(guó)家生化危害安全規(guī)章要求處理。

21) 試劑盒內(nèi)相關(guān)危害物質(zhì)信息詳見(jiàn)MSDS,可向DRG索取

 

操作注意事項(xiàng)

1) 實(shí)驗(yàn)前,所有試劑和樣本都應(yīng)平衡至室溫,混合時(shí)避免出現(xiàn)氣泡。

2) 實(shí)驗(yàn)一旦開(kāi)始,必須無(wú)中斷的完成全部試驗(yàn)。

3) 避免交叉污染,每次加樣時(shí)都使用新的槍頭。

4) 吸收值與溫育時(shí)間和溫度有關(guān),試驗(yàn)開(kāi)始前,將所有試劑準(zhǔn)備好,打開(kāi)蓋子,所需板條固定于板架上等,確保無(wú)間斷的,時(shí)間間隔一致的加樣。

5) 酶反應(yīng)一般規(guī)則,時(shí)間和溫度是一個(gè)線性相關(guān)關(guān)系。

 

僅供科研使用


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