線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性測試盒操作程序
測定意義:線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C氧化酶,也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C的氧化,并最終把電子傳遞給氧,生成水。
測定原理:還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收,線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C生成氧化型細(xì)胞色素C,因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。
需要的儀器,耗材:可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本處理
1. 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,加入 1.0 mL 提取液,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。4 ℃ 600g 離心 10min。
2. 將上清液移至另一離心管中,4 ℃ 11000g 離心 15min。
3. 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ(此步可選做,可以判斷線粒體提取效果)。
4. 在沉淀中加入 400uL 提取液,超聲波破碎(功率 20%,超聲 5 秒,間隔 10 秒,重復(fù) 15 次),用于復(fù)合體Ⅳ 酶活性測定,并且用于蛋白含量測定。