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人磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K) ELISA檢測試劑盒操作方法

發(fā)布時(shí)間:2018-01-29   點(diǎn)擊次數(shù):3919次

本試劑盒只能用于科學(xué)研究,不得用于醫(yī)學(xué)診斷

人(Human)磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K)

ELISA檢測試劑盒

使用說明書

檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K)抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

酶標(biāo)儀(450nm)
高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

  試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
  濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白;按照說明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍,zui終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。
  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
  所有液體組分使用前充分搖勻。

 

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

  手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
  自動(dòng)洗板機(jī):每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;
  樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。
  除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。
  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
  每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在Excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

 

試劑盒性能

 準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,大于等于0.9900。
 靈敏度:zui低檢測濃度小于1.0 mU/L。
 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
 有效期:6個(gè)月

免責(zé)聲明

  試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn),否則所產(chǎn)生的一切后果,由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),本公司概不負(fù)責(zé)。
  嚴(yán)格按照說明書操作,實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作,后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。

  

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